1、安全柜操作前應將本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免雙臂頻繁穿過氣幕破壞氣流；并且在移入前用70%酒精擦拭表面消毒，以去除污染。
2、打開風機5～10分鐘，待柜內空氣凈化并氣流穩定后再進行實驗操作。將雙臂緩緩伸入安全柜內，至少靜止1分鐘，使柜內氣流穩定后再進行操作。
3、安全柜內不放與本次實驗無關的物品。柜內物品擺放應做到清潔區、半污染區與污染區基本分開，操作過程中物品取用方便，且三區之間無交叉。物品應盡量靠后放置，但不得擋住氣道口，以免干擾氣流正常流動。
4、操作時應按照從清潔區到污染區進行，以避免交叉污染。為防可能濺出的液滴，可在臺面上鋪一用消毒劑浸泡過的毛巾或紗布，但不能覆蓋住安全柜格柵。
5、柜內操作期間，嚴禁使用酒精燈等明火，以避免產生的熱量產生氣流，干擾柜內氣流穩定；且明火可能損壞HEPA濾器。
6、工作時盡量減少背后人員走動以及快速開關房門，以防止安全柜內氣流不穩定。
7、在實驗操作時，不可打開玻璃視窗，安全柜應保證操作者臉部在工作窗口之上。在柜內操作時動作應輕柔、舒緩，防止影響柜內氣流。
8、安全柜應定期進行檢驗與保養，以保證其正常工作。工作中一旦發現安全柜工作異常，應立即停止工作，采取相應處理措施，并通知相關人員。
 9、工作完全后，關閉玻璃窗，保持風機繼續運轉10～15分鐘，同時打開紫外燈，照射30分鐘。
10、安全柜應定期進行清潔消毒，柜內臺面污染物可在工作完成且紫外燈消毒后用2%的84消毒液擦拭。柜體外表面則應每天用1%的84消毒液擦拭。
11、柜內使用的物品應在消毒后再取出，以防止將病原微生物帶出而污染環境。